基金项目:国家自然科学基金(21373158); 陕西科技厅中澳合作项目(2013KW17)
通讯作者:刘向荣(1966-),女,陕西西安人,教授, E-mail:liuxiangrongxk@163.com
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xi'an University of Science and Technology,Xi'an 710054,China)
DOI: 10.13800/j.cnki.xakjdxxb.2017.0216
利用产碱假单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌和粗毛栓菌4种微生物对内蒙古褐煤进行溶煤实验,探索了煤样粒度、氧化程度、溶煤时间和溶煤方式等因素对溶煤率的影响,并对溶煤产物进行了红外光谱(IR)、紫外光谱(UV-VIS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析。结果 发现,当煤样粒度为0.074~0.125 mm,氧化程度为10 mol/L硝酸浸泡处理48 h,溶煤时间为14 d和以摇瓶培养的方式进行溶煤时效果最好,此条件下铜绿假单胞菌的溶煤率最高,达62.61%.IR分析结果显示,残煤红外光谱图与氧化煤红外光谱图相比,羟基振动峰增强,芳烃结构振动峰减弱; UV-VIS分析结果显示,溶煤产物的主要成分为苯酚衍生物、醛类和醚类化合物; GC-MS分析结果显示,氧化煤经过微生物溶解以后,其结构发生变化,部分溶解为低分子量化合物。
Biosolubilization of Inner Mongolia lignite by Pseudomonas alcaligenes,Pseudomonas stuzeri,Pseudomonas aeruginosa and Trametes hirsute were studied.The grain size of coal sample,degree of oxidation,time of biosolubilising coal and the mode of biosolubilising coal were investigated,which influenced the percentage of biosolubilization.The coal biosolubilization products were characterized by UV-VIS,IR spectrum and GC-MS.The results showed that the percentage of biosolubilization was better when the coal sample size was 0.074~0.125 mm,oxidized by 10 mol/L nitric acid for 48 hours,biosolubilising time was 14 days and shaking culture was chosen,Pseudomonas aeruginosa was the highest,which was 62.61%.IR analysis showed the residual coals comparing with oxidized coal had stronger hydroxyl vibration peak and weaker aromatic vibration peak.UV-VIS analysis showed the main components of products are phenol derivatives,aldehydes and ethers.According to GC-MS analysis,the structure of oxidized coal was partly changed into low molecular weight compounds after the process of biosolubilization.
中国褐煤资源十分丰富,储量达1 300亿t,占中国煤储量的13%,其中内蒙古褐煤储量占中国褐煤总储量的3/4以上[1-2]。煤的直接燃烧会释放大量的氮化物和硫化物等有毒气体,引起一系列的环境问题[3]。煤的洁净处理和利用成为煤“绿色”利用的途径,煤的微生物溶解就是其中的一种方法,这是由于煤是植物遗体在地层下经过长期的作用形成的[4-7],煤中还保留有大量的木质素与多环芳烃等物质结构[8-10],因此,利用微生物来实现煤中木质素和多环芳烃等结构的溶解与液化是行之有效的途径之一。自上世纪80年代德国Fakoussa博士[11]和美国Cohen教授[12]分别报道了某些真菌能在煤块上生长,并将煤转化成黑色水溶液以来,煤的微生物转化在世界上已引起了许多研究者的关注[13-14]。近年来,许多科研工作者致力于溶煤菌种选育、溶煤机理和对溶煤产物的应用等方面的研究,在微生物溶煤机理方面取得了较大的进展,形成了被广泛接受的4大溶煤机理[15-18]; 溶煤产物应用方面也有成功的例子,诸如用微生物溶解褐煤制备肥料和土壤调节剂[19],或生产生物可降解塑料[20]。但是,由于煤种的多样性,导致溶煤条件、菌煤匹配和溶煤产物等方面尚无一定规律可循,因此,进行大量和深入的微生物溶煤实验探索势在必行。
以内蒙古褐煤为研究对象,探讨煤样粒度、氧化程度、溶煤时间和溶煤方式等溶煤条件对溶煤率的影响,利用红外光谱分析、紫外光谱分析和气相色谱-质谱联用分析等技术对溶煤产物与残煤进行分析,研究微生物溶煤产物与溶煤前后氧化煤结构的变化,为进一步研究微生物溶煤过程的规律提供理论依据。
煤样采自内蒙古四联煤矿。先进行破碎,筛分为0.074~0.125 mm,0.125~0.250 mm和0.250~0.500 mm 3个粒度,经干燥,最后分装备用。
选用4种微生物,3种细菌分别为产碱假单胞菌、施氏假单胞菌和铜绿假单胞菌,1种真菌为粗毛栓菌。除铜绿假单胞菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)外,其余3株菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。4株菌均采用甘油保藏法保藏于西安科技大学化学与化工学院微生物实验室生化冰箱中。
产碱假单胞菌能够产生碱性物质,施氏假单胞菌能够降解芳烃类物质,铜绿假单胞菌能够分泌表面活性剂鼠李糖脂,粗毛栓菌能够产生木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶,对木质素具有较好的降解能力。以上4株菌所产生的活性物质符合4大溶煤机理的溶煤条件。
实验中4种微生物,产碱假单胞菌与施氏假单胞菌所用培养基相同,为营养肉汤琼脂培养基(NB); 粗毛栓菌和铜绿假单胞菌所用培养基分别为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和LB培养基。培养基组成见表1.
BL-50A立式压力蒸汽灭菌器,50 L,0.22 MPa,最高温度为135 ℃; BC-360生化培养箱,温度范围为0~60 ℃; PE-2400-Ⅱ元素分析仪; KZDL-8B型微机自动定硫仪; Perkin Elmer GXIV-5.0.1傅里叶变换红外光谱仪; HZQ-F100全温振荡培养箱,转速50~260 rpm,温度范围5~60 ℃; TU-1900双光束紫外可见分光光度计; 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。
分别对粒度为0.074~0.125 mm,0.125~0.250 mm和0.250~0.500 mm的内蒙古褐煤用6,8和10 mol/L的硝酸进行浸泡氧化,48 h后用蒸馏水对其进行抽滤,洗净,直到滤液的pH值接近7.0为止[21-23]。将不同氧化程度、不同粒度的煤样经立式压力蒸汽灭菌器121 ℃灭菌15 min,然后将煤样转移至已灭菌的样品袋中。每次实验前将样品袋中氧化灭菌后的煤样放入70 ℃的电热鼓风干燥箱中烘干至恒重即可。内蒙古褐煤原煤与8 mol/L硝酸处理氧化煤的工业分析与元素分析数据见表2.
从表2可以看出,内蒙古褐煤的水分与固定碳含量相对较高,分别为12.69%和51.32%,C元素含量高,灰分含量与其它元素含量相对较低,属于低变质程度煤。经过硝酸氧化预处理以后,水分、灰分和固定碳含量均降低,挥发份含量升高,H元素含量降低,N,O元素含量升高,S元素含量降至0.
将4株菌从安瓿瓶中接种到固体培养基上进行活化培养,冻干菌株活性较低,为保证4株菌的纯度和活性,需对其进行3次复筛与纯化培养[24-27]。将复筛得到的4株纯菌株接种到事先配制好并灭过菌的液体培养基中,在30 ℃,160 r/min的全温振荡培养箱中进行扩大培养,备用。
为提高菌株适应新环境的能力,须在其到达对数生长期时接入溶煤实验中,4株菌的生长曲线如图1所示,产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌与粗毛栓菌生长周期各阶段时间见表3.
从图1和表3可以看出,产碱假单胞菌与铜绿假单胞菌的最佳接种时间为第3天,施氏假单胞菌与粗毛栓菌的最佳接种时间为第4天。
溶煤实验结束后,过滤,回收残渣,清洗,烘干称重,按照公式(1)计算溶煤率[28]。
P=(1-(W1)/(W0))×100%.(1)
式中 P为微生物溶煤转化率,%; W0为煤样的初始质量,g; W1为煤样溶解后残煤的质量,g.W0,W1均为空气气氛干燥下煤样的质量。
通过此4株菌与内蒙古褐煤的前期溶煤实验探索,选择培养基体积为50 mL,菌液接种量为5.00 mL,煤样质量为0.50 g,在培养基组成、培养温度(30 ℃)和转速(160 r/min)等培养条件相同的情况下,分别改变煤样粒度(0.074~0.125 mm,0.125~0.25 mm,0.25~0.50 mm)、氧化程度(6 mol/L硝酸氧化、8 mol/L硝酸氧化、10 mol/L硝酸氧化)、溶煤时间和溶煤方式,研究各因素对溶煤率的影响。每批次溶煤实验设3组平行试验,并设置一组对照试验,各因素实验的溶煤率均采用(1)式进行计算。
在150 mL三角瓶中加入50 mL液体培养基,然后加入粒度为0.074~0.125 mm,经8 mol/L硝酸氧化的煤样0.50 g,最后加入处于对数生长期的菌液5.00 mL,在30 ℃,160 r/min的全温振荡培养箱中培养14 d.实验结束后,过滤,分离溶煤产物,收集残煤,除掉溶煤产物中的残余菌丝体,提高其纯度,并用蒸馏水对残煤进行清洗,直至残煤中无菌体残留,烘干备用。
取干燥后的煤样2 mg与200~400 mg干燥的KBr混合研磨至粉末,放入压片剂制备成薄片,在450~4 000 cm-1波段下进行红外扫描,分辨率为4 cm-1; 以蒸馏水作为参比液,对4株菌的溶煤产物进行紫外-可见光谱连续扫描,扫描波长范围为190~400 nm; 分别用乙酸乙酯、石油醚、丙酮和甲苯对洗煤水与溶煤产物进行萃取,萃取产物进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析[29],气氛N2,最高温度300 ℃,气相色谱柱型为HP-5MS(crosslink 5% PH ME Siloxane,30 m×0.25 mm i.d.,0.25 um film thickness),质谱质量扫描范围为30~500 amu.
在150 mL三角瓶中加入50 mL液体培养基,然后加入经8 mol/L硝酸氧化、已灭菌、3种粒度的煤样各0.50 g,最后加入处于对数生长期的菌液5.00 mL,在30 ℃,160 r/min的全温振荡培养箱中培养14 d.实验设置3组平行试验,并设置一组对照试验。4株菌对3种不同粒度内蒙古褐煤的溶煤率见表4.
从表4可以看出,4株菌均在煤样粒度为0.074~0.125 mm时表现出最好的溶煤效果,同时可见,在煤样粒度为0.074~0.500 mm范围内,溶煤率随着粒度增大而减小。产碱假单胞菌、施氏假单胞菌和铜绿假单胞菌在粒度为0.074~0.125 mm时的溶煤率分别为39.88%,41.38%和60.26%,明显高于其它2个粒度的溶煤率。产碱假单胞菌在粒度为0.074~0.125 mm,0.125~0.250 mm和0.250~0.500 mm时的溶煤率分别为39.88%,29.92%和19.51%,变化幅度基本相同。施氏假单胞菌在粒度为0.125~0.250 mm和0.250~0.500 mm是的溶煤率相差不大,分别为30.07%和29.40%,当粒度为0.074~0.125 mm时其溶煤率为41.38%,有较大提高; 铜绿假单胞菌在粒度为0.074~0.125 mm时的溶煤率明显高于产碱假单胞菌和施氏假单胞菌的溶煤率。粗毛栓菌菌丝体的包裹导致其溶煤率较低,但仍符合粒度越大溶煤效果越差的规律。由此可见,煤样粒度的大小对生物溶煤率的影响非常大,这是因为煤样粒度越小其比表面积越大,接触面积越大,煤样可被溶解部分暴露在菌液中的面积越大,煤样与溶煤活性物质接触的概率也就越大,溶煤率越高。
在150 mL三角瓶中加入50 mL液体培养基,然后加入氧化程度分别为6 mol/L硝酸氧化、8 mol/L硝酸氧化和10 mol/L硝酸氧化、粒度为0.074~0.125 mm的煤样各0.50 g,最后加入处于对数生长期的菌液5.00 mL,在30 ℃,160 r/min的全温振荡培养箱中培养14 d.实验设置三组平行试验,并设置一组对照试验。4株菌对不同氧化程度内蒙古褐煤的溶煤率见表5.
从表5可以看出,煤样的氧化程度对微生物的溶煤率具有很大的影响,本实验中4株菌表现出相同的趋势,即氧化程度越高溶煤率越高。这是由于硝酸浓度越高对内蒙古褐煤的氧化效果越好,对煤样外层原本相对稳定结构的破坏程度越高,从而为生物活性物质对其作用提供了更多的接触位点,有利于溶煤率的提高,此论点后期将进一步进行验证。不同的菌种对相同氧化程度煤样的溶解效果也存在很大差别,同时说明,不同的菌种对同一种煤作用的活性物质可能不同,其溶煤能力也存在很大的差距。
在150 mL三角瓶中加入50 mL液体培养基,然后加入粒度为0.074~0.125 mm,经10 mol/L硝酸氧化的煤样0.50 g,最后加入处于对数生长期的菌液5.00 mL,在30 ℃,160 r/min的全温振荡培养箱中进行培养,每隔一天测定一次溶煤率。实验设置三组平行试验,并设置一组对照试验。4株菌在不同培养时间下的溶煤率如图2所示。
从图2可以看出,在0~14 d内,随着培养时间的增加,4株菌的溶煤率均升高,其中产碱假单胞菌与铜绿假单胞菌能较快适应环境并释放活性物质进行溶煤。铜绿假单胞菌与施氏假单胞菌在第10天,产碱假单胞菌与粗毛栓菌在第8天时溶煤率不再升高,溶煤过程基本结束。从图2还可以看出,不同菌株在同一时刻的溶煤效果也不同,说明不同菌株的环境适应能力不同,溶煤活性物质分泌时间与多少也不同,从而导致溶煤速度不同。溶煤过程结束后,从图2中可以明显看出,各菌株的溶煤能力存在较大差别,其中铜绿假单胞菌的溶煤能力最强,溶煤率达59.22%,由于粗毛栓菌菌丝体会将煤样包裹其中,导致溶煤能力受到很大影响,溶煤率较低。
在150 mL三角瓶中加入50 mL液体培养基,然后加入粒度为0.074~0.125 mm,经10 mol/L硝酸氧化的煤样0.50 g,最后加入处于对数生长期的菌液5.00 mL.分别在30 ℃,160 r/min全温振荡培养箱与30 ℃恒温生化培养箱中培养14 d.实验设置3组平行试验,并设置一组对照试验。4株菌在不同培养方式下的溶煤率如图3所示。
图3 不同培养方式下4株菌的溶煤率
Fig.3 Coal biosolubilization percentage of four strains under different cultivation ways
从图3可以看出,产碱假单胞菌,施氏假单胞菌和铜绿假单胞菌的摇瓶培养溶煤率高于相对应静置培养溶煤率,原因是摇瓶培养时培养基的溶氧率较高,有利于菌株的生长繁殖,同时,摇瓶培养时菌株产生的活性物质能够充分与煤样接触,有利于溶煤过程的进行; 粗毛栓菌摇瓶培养时菌丝体容易将煤样包裹而静置培养时煤样不易被包裹,导致其静置培养溶煤率高于摇瓶培养溶煤率。
图4为氧化煤与4株菌溶煤后残煤的红外光谱对照图,表6为氧化煤与4株菌溶煤后残煤的红外谱峰归属。从图4中可以看出,氧化煤与4株菌溶煤后残煤的红外光谱整体走势基本相同。铜绿假单胞菌残煤峰形最强,峰面积最大,粗毛栓菌残煤峰形最弱,峰面积最小。结合图4与表6,由波数3 437 cm-1附近的O—H伸缩振动吸收峰可知,氧化煤以及残煤中存在—OH,并且铜绿假单胞菌残煤红外谱图吸收峰加强,说明溶煤后残煤中—OH增加; 波数3 130 cm-1附近芳烃的—CH伸缩振动与860 cm-1附近芳烃的—CH弯曲振动显示,铜绿假单胞菌残煤中存在芳烃类结构[30]; 波数2 918 cm-1附近存在环烷烃或者脂肪烃—CH3振动峰; 波数2 352~2 345 cm-1附近存在—COOH振动峰; 波数1 630 cm-1和1 385~1 352 cm-1附近存在芳环骨架振动峰,波数1 060 cm-1附近存在C—O振动峰,波数541 cm-1附近存在S—S伸缩振动峰。因此,氧化煤与4株菌溶煤后残煤中均存在醚类结构[28],溶煤后残煤中存在苯酚类结构和醚类、羧酸类物质。
图5为4株菌溶煤产物紫外光谱图。从图5可以看出,产碱假单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌和粗毛栓菌4株菌溶煤的液体溶煤产物谱图十分相似,都只有一个明显的吸收带。根据图中200 nm附近出现的最大吸收峰推测,是由共轭双键中π-π共轭跃迁所引起,确定液体溶煤产物中存在较多不饱和结构,如醛、酮、酸类物质; 同时,此吸收峰也符合芳香化合物的特征吸收特征,推断液体产物中存在芳香族物质,由此可以说明4株菌溶煤产物中的大分子量芳香类物质被溶解为其它不饱和小分子量物质。
图6为溶煤产物气相色谱-质谱联用分析谱图。图6中(a)图为乙酸乙酯萃取GC-MS对照图,(b)为石油醚萃取GC-MS对照图,(c)图为丙酮萃取GC-MS对照图谱,(d)图为甲苯萃取GC-MS对照图。从图6还可以看出,溶煤产物中有更多化合物被检出,且这些化合物多为芳香族羧酸或芳香酯,还有部分小分子量烷烃。
将检测出的物质进行分类,根据其峰面积计算各类化合物的相对含量,洗煤水与溶煤产物不同萃取方式的分析结果见表7.
表7 不同溶剂萃取洗煤水与溶煤产物结果分析
Tab.7 Analysis of coal-washing water and products by different extraction solvent
从表7可以看出,当萃取剂为乙酸乙酯时,溶煤产物与洗煤水相比,烃类、醇类、醛、酮、醚类和酸类化合物含量降低,酯类化合物含量上升,原因是氧化煤经过微生物作用以后部分烃类、醇类、醛、酮、醚类和酸类物质被溶解为酯类物质,而乙酸乙酯是酯类物质,根据“相似相溶”原理,大部分酯类物质被萃取到萃取剂中; 当萃取剂为石油醚时,溶煤产物与洗煤水相比,烃类、酯类、醇类化合物含量降低,醛、酮、醚类和酸类化合物含量升高; 当萃取剂为丙酮时,溶煤产物与洗煤水相比,烃类、酯类化合物含量降低,醇类和酸类化合物含量升高,醛、酮、醚类化合物含量几乎没有变化; 当萃取剂为甲苯时,溶煤产物与洗煤水相比,烃类和酸类化合物含量升高,酯类和醛、酮、醚类化合物含量降低,醇类化合物含量不变。因此,经过微生物溶解作用后,溶煤产物中烃类、酯类、醇类和醛、酮、醚类化合物含量降低,酸类化合物含量升高; 同时,溶煤产物中芳香族化合物减少,低分子量化合物、不饱和化合物增加,说明经过微生物的作用,氧化煤中芳香族类大分子量物质被部分溶解为其它小分子量物质。
1)通过单因素实验得到最佳溶煤条件,当采用煤样粒度为0.074~0.125 mm,氧化程度为10 mol/L硝酸浸泡处理48 h,溶煤时间为14 d和摇瓶培养的条件进行溶煤时溶煤率达到最高。在此最优条件下,铜绿假单胞菌溶煤率最高,达到62.61%;
2)红外光谱分析结果显示,氧化煤与微生物溶解后的残煤谱图十分接近,存在—OH伸缩振动峰与苯环振动峰,说明存在苯酚类物质,同时,出现C—O—C振动峰与—COOH振动峰,说明所选内蒙古煤中存在醚类和羧酸类物质; 紫外光谱显示,溶煤产物中存在苯酚类衍生物、醛类、酮类等物质;
3)溶煤产物的GC-MS谱图比洗煤水GC-MS谱图检出更多化合物,其中多数为芳香酸或醚类物质; 且经过微生物的溶解作用,溶煤产物中烃类、酯类、醇类和醛、酮、醚类化合物含量降低,酸类化合物含量升高; 溶煤产物中芳香族化合物减少,低分子量化合物、不饱和化合物增加,说明原煤中的芳香族类物质被部分溶解为其它小分子量物质。